Структура ФНО. ФНО человека известен как белок, состоящий из 157 аминокислотных остатков (а. о.), с молекулярной массой 17356 Да, его аминокислотная последовательность:

Выделены жирным шрифтом консервативные аминокислотные остатки (а. о.), гомологичные в ФНО человека, мыши, быка и кролика. Подчеркнуты а. о. идентичные для ФНО и лимфотоксина (ЛТ, ранее назывался ФНО-бэта) человека. Звездочками отмечены а. о., формирующие потенци¬альный локус для связывания с рецептором; буквами t - а. о., находящиеся на конформационных цепях, участвующих во взаимо-действии мономеров для образования тримера, Т - то же, но обеспечивающие вандерваальсовые или электростатические взаи¬модействия [Eck, Sprang, 1989]. Пунктирной линией подчеркнута основная антигенная детерминанта ФНО. Биологической активностью обладает тримерная форма ФНО, образующаяся за счет ионного и гидрофобного взаимодействия мономеров и связывающаяся с рецепторами на различных типах клеток. Модели трехмерной структуры ФНО и ЛТ показаны на рис. 1.

Белым, синим и черным цветом показаны мономеры, красным показаны аминокислоты, мутации в которых нарушали связывание с рецептором и цитотоксичность. Для ФНО это – а. о. с 84 по 91 на белой субъединице, с 30 по 34 (вверху) и с 143 по 149 (внизу) на черной. Для ЛТ это – Tyr-108 на белой субъединице и Asp-50 на черной [Eck et al., 1992]. Удельная цитотоксичность ФНО на клетках L-929 составляет 2.107 ЕД на мг белка в присутствии актиномицина Д [Smith, Baglioni, 1987]. ФНО синтезируется в клетках в виде предшественника, состоящего из 233 а. о., N-концевая часть которого, 76 ами¬нокислотных остатков, участвует в секреции и в формировании мембраносвязанной формы ФНО. У всех членов ФНО-семейства N-концевая последовательность высоко консерва¬тивна (76 % гомологии), что позволяет предполагать ее важ¬ную, но пока неясную, биологическую роль. При сравнении ами-нокислотных последовательностей ФНО и ЛТ выявлена существен¬ная 50 %-ная гомология в двух участках, 35-66 и 110-133 а. о. (нумерация по ФНО). Эти участки конформационно сближены за счет образования петли разделяющей их негомологичной об¬ласти. Петля в молекуле ФНО стабилизируется внутримолекуляр-ной S-S связью между цистеиновыми остатками в положениях 69 и 101 [Pennica et al., 1984]. Синтез ФНО в организме. Синтез ФНО не наблюдается в нестимулированных клетках и ФНО не определяется в сыворотке крови здоровых животных и человека. Ак¬тивация макрофагов липополисахаридами (ЛПС) или другими стимуляторами приводит к индукции синтеза ФНО через 15-20 мин. Предварительная обработка макрофагов дексаметазоном предотв¬ращает синтез ФНО, вызываемый ЛПС, на уровне ингибирования трансляции м-РНК [Beutler, Cerami, 1988]. In vivo ФНО синтезируется в основном макрофагами в от¬вет на их активацию при различных заболеваниях. При исследо¬вании плазматических мембран макрофагов установлено, что ФНО находится в их составе, как в виде интегрального белка, так и в связанной с рецептором форме. Изолированные мембраны макрофагов при этом обладают цитотоксическим действием против ФНО-чувстви¬тельных опухолевых клеток [Luettig et al., 1989]. Наиболее активно ФНО продуцируется макрофагами, стиму¬лированными ЛПС (1 мкг), уровень продукции был выше в при¬сутствии индометацина. Предварительная активация макрофагов in vivo внутрибрюшинным введением Corinebacterium parvum приводила к увеличению продукции ФНО. Увеличение температуры до 41 оС не влияло на продукцию ФНО, но усиливало цитотокси¬ческий эффект на клетках L-929 [Danielova et al., 1991]. Мононуклеарные лейкоциты синтезируют ФНО при индукции не только ЛПС, но и ФГА, Кон-А, митогеном лаконоса, убитыми микроорганизмами S. aureus и B. pertussis, столбнячным ана¬токсином, коклюшными токсином и гемагглютинином [Ferrante et al., 1990]. Мононуклеарные клетки плевральной жидкости чело¬века начинают синтезировать ФНО под воздействием компонентов клеточной стенки Mycobacterium tuberculosis: ЛПС в дозе 0,1 мкг/мл, белок-пептидогликанового комплекса (содержит Т-кле¬точные эпитопы) или липоарабиномананнана (супрессор Т-кле¬точной реактивности) в дозах 10 мкг/мл [Barnes et al., 1990].

Токсин из касторовых бобов рицин в концентрациях 5-10 пМ также способен индуцировать синтез ФНО и ИЛ-1β периферичес¬кими мононуклеарными клетками человека [Licastro et al., 1993]. ФНО является необходимым аутокринным фактором роста и дифференцировки самих макрофагов. Показана регулирующая роль ФНО на пролиферацию макрофагов в процессе их дифференциров¬ки. Макрофаги костного мозга мыши в ранних стадиях дифферен¬цировки синтезируют эндогенный ФНО. Добавление антисмысловых олигонуклеотидов приводило к блокированию эндогенного синте¬за ФНО и увеличению неконтролируемой пролиферации костномоз¬говых макрофагов в присутствии ГМ-КСФ с уменьшением их диф¬ференцировки [Witsell, Schook, 1992]. Лимфокины, такие как ИФН-гамма, М-КСФ и ГМ-КСФ, могут "при¬мировать" клетки для усиления синтеза ФНО при последующей их стимуляции ЛПС [Meager et al., 1989].

Однако предварительное введение ЛПС в низких (10 нг/мл) дозах вызывает толерантность и эффективно супрессирует ФНО-продукцию при последующих введениях ЛПС (1 мкг/мл). Ме¬ханизм толерантности включает синтез простагландина Е2 и ак¬тивацию протеинкиназы С. Циклооксигеназные ингибиторы индо¬метацин или ибупрофен ингибируют толерантность. В моно¬цитах с вызванной ЛПС толерантностью активируется фактор яд¬ра клетки NF-kB (фактор транскрипции), но транскрипции ФНО-гена при этом не происходит [Haas et al., 1990]. Т-клетки периферической крови человека также способны вырабатывать ФНО при их активации через рецепторы CD2 или CD3, и такая выработка зависит от присутствия в среде ИЛ-2. При активации клеток через CD3-рецептор сначала усиливается синтез ИЛ-2, а затем ФНО. При активации через CD2 рецептор синтез ФНО не усиливается без экзогенного ИЛ-2 [Lorre et al., 1992]. Периферические Т-лимфоциты человека после однократной стимуляции митогенами Кон-А и ФМА начинают синтезировать ФНО и лимфотоксин.

Накопление м-РНК ФНО достигает максимума че¬рез 6 часов и возвращается к фоновым величинам через 24 ча¬са. М-РНК лимфотоксина накапливается медленно с максимумом через 18 часов и сохраняет повышенный уровень до 48-72 ча¬сов. ФНО-транскрипционный пик при этом в 4-10 раз больше лимфотоксинового, но время полужизни м-РНК лимфотоксина в 8-10 раз продолжительней. Эти результаты показывают, что ге¬ны ФНО и лимфотоксина подвержены дифференциальной регуляции в Т-лимфоцитах [English et al., 1991]. Некоторые линии опухолевых клеток синтезируют ФНО, в частности, HL-60 клетки промиелоцитарного лейкоза, стимули¬рованные ФМА [Aggarwal et al., 1985]. Моноцитарные лейкеми¬ческие клетки U-937 и TPH-1 синтезируют ФНО-подобные цито¬токсические факторы, отличающиеся от ФНО аминокислотными за¬менами в первых 12 N-концевых а. о. [Soma et al., 1987]. Определение уровня активности ФНО у 58 пациентов с ост¬рыми лейкозами показало, что его уровень был значительно вы¬ше при острых моноцитарных и миеломоноцитарных лейкозах, чем у пациентов с острыми лимфобластными и гранулоцитарными лей¬козами (P<0,05) [Zeng, 1992]. Исследование опухолевых клеток 57 пациентов (21 с острым миелобластным лейкозом; 14 с острым лимфобластным лейкозом; 12 с Фи¬ладельфийскими хромосом-позитивными миелобластным хроническим [бластная фаза] или острым лейкозами; 5 с хроническим лимфоци¬тарным лейкозом; 5 с хроническим миеломоноцитарным лейкозом) на экспрессию ИЛ-1β- и ФНО-транскриптов Northern-гибридизацией выявило, что м-РНК ФНО обнаружена в образцах почти от поло¬вины (47 %) пациентов. Исключение составили все T-клеточные острые лимфобластные лейкозы. Экспрессия отмечалась с боль¬шой частотой в образцах (12 из 15 [80 %]) моноцитарных ост¬рых и хронических лейкозов и прогрессирующих хронических лимфоцитарных лейкозов (4 из 5 образцов [80 %]). ИЛ-1 транс¬крипты были обнаружены в 20 из 57 образцов (35 %). Таким образом, м-РНК ФНО и/или ИЛ-1 могут быть с высокой частотой найдены в В-клеточных острых лимфобластных лейкозах, хрони¬ческих и острых миелоидных, моноцитарных или лимфоцитарных лейкозах [Kurzrock et al., 1993]. Некоторые линии клеток сарком человека, в отличие от нормальных фибробластов, начинали синтезировать ФНО после рентгеновского облучения. Подъем уровня синтезируемого ФНО отмечался через 20 часов после облучения, достигал максимума к 3-му дню и оставался повышенным 5 дней. Уровень м-РНК ФНО в клетках повышался в несколько раз через несколько (3-6) часов, отличаясь кинетикой среди клеточных линий. Сочетание добавления экзогенного ФНО с рентгеновским облучением имело синергический эффект в киллинге некоторых линий ФНО-продуци¬рующих и не продуцирующих клеток. На других линиях клеток по¬добный эффект отсутствовал [Hallahan et al., 1989]. Рецепторы для ФНО. ФНО взаимодействует с различными клетками через рецеп¬торы, находящиеся на их поверхности. В настоящее время большая часть публикаций посвящена двум типам ФНО-рецепторов с молекулярными массами 55 и 75 кДа, обнаруженным на различных клетках. Эти работы опираются в основном на использование моноклональных антител серии utr против ФНО-рецептора 75/65 кДа и серии htr против 55/50 кДа-рецептора, полученных специалистами фирмы Hoffmann-La Roche.

Применение этих моноклональных антител показало, что линии клеток HeLa, Hep-2 и MSF-7 имеют только 55 кДа-рецеп¬тор, клетки U-937, HL-60, очищенные моноциты и гранулоциты периферической крови - оба рецептора. Классически используе¬мые для тестирования ФНО линии клеток L-929 и WEHI-164, оказалось, взаимодействуют с ФНО в присутствии обеих серий мо¬ноклональных антител. Это обстоятельство указывает на то, что на поверхности этих клеток имеются рецепторы другого ти¬па. Клетки Raji не имеют определяемых проточной цитометрией ФНО-связывающих сайтов. Отмечено также, что моноклональные антитела htr (анти-R55), но не utr, имеют ФНО-подобную ак-тивность при определении цитотоксичности, роста фибробластов и ИЛ-6 секреции [Brockhaus et al., 1990]. ФНО и ЛТ связываются с рецептором 55 кДа с константами 160 и 67 пм, а с рецептором 75 кДа - 10 и 21 пм, соответс¬твенно [Schoenfeld et al., 1991].

Противовоспалительный пре¬парат сульфасалазин препятствует связыванию ФНО с рецептора¬ми и ингибирует цитотоксические функции Т-лимфоцитов, их су¬пернатантов и рекомбинантного ФНО [Shanahan et al., 1990]. С помощью моноклональных антител против ФНО-рецепторов 55 и 75 кДа анализировано наличие этих рецепторов на клетках различных лимфоидных органов. В тимусе 75 кДа-рецептор опре¬делялся на медуллярных лимфобластах и дендритных клетках; в лимфатических узлах и миндалинах - на активированных лимфо¬цитах и интердигитальных клетках ретикулума Т-зависимых зон. 55 кДа-рецептор выявлялся на дендритных клетках зародышевых центров ретикулума, которые являются главным местом продук¬ции ФНО [Ryffel et al., 1991a, 1991b]. Оба ФНО-рецептора 55 и 75 кДа обнаружены и на естест¬венных киллерных клетках (CD56+). Стимулирование НК-клеток ИЛ-2 и добавление ФНО увеличивает их пролиферативную актив¬ность. Моноклональные антитела к 55- и 75 кДа-рецепторам ин¬гибируют пролиферацию, индуцированную ИЛ-2, что свидетельст¬вует о вовлечённости этих рецепторов в процесс пролиферации НК-клеток [Naume et al., 1991]. На Т-лимфоцитах/киллерах человека 55 кДа-рецептор инду¬цировался ИЛ-2. Дополнительная обработка ИЛ-1, ИЛ-4 и ИЛ-6 усиливала транскрипцию м-РНК рецептора, экспрессию рецептора на мембране и секрецию ФНО [Dett et al., 1991]. В сыворотках крови обнаружена повышенная концентрация растворенного рецептора к ФНО у ВИЧ-инфицированных лиц. У серонегативных мужчин-гомосексуа-листов концентрация составила 4,4 нг/мл, у асимптоматических серопозитивных - 5,2 и у больных СПИДом - 9,5 нг/мл [Kalinko¬vitch et al., 1992]. Белок, ингибитор ФНО, с молекулярной массой 33 кДа был выделен из мочи лихорадящих больных с температурой более 38,5 оС. Этот белок взаимодействовал с ФНО, блокируя его способность связываться с клетками U-937, индуцировать про-дукцию фибробластами простагландина Е2 и экспрессию ИЛ-1 [Seckinger et al., 1989]. В дальнейших исследованиях были по¬лучены антитела против ФНО-ингибитора и выявлено, что они взаимодействуют также с ФНО-рецептором (95 кДа, поперечно сшитый с ФНО) на клетках U937 и на ФГА/ИЛ-2-стимулированных Т-лимфоцитах [Seckinger et al., 1990]. В сыворотках крови пациентов больных раком простаты, молочной железы, мозга или кишечника содержится 28 кДа бе¬лок, связывающий ФНО человека и мыши и блокирующий их цито¬токсическую активность. Менее эффективно он взаимодействовал и нейтрализовал лимфотоксин. Его N-концевая аминокислотная последовательность Asp-Ser-Val-Cys-Pro соответствовала и ФНО-связывающим белкам, выделенным из мочи женщин в менопау¬зе и из мочи пациентов с хронической почечной недостаточ¬ностью [Gatanaga et al., 1990]. В последующем, основываясь на аминокислотной последовательности этого ФНО-связывающего белка были синтезированы олигонуклеотидные зонды и использо¬ваны для клонирования соответствующего гена. Оказалось, что это ген 55 кДа ФНО-рецептора [Schall et al., 1990]. Протеолитически отщепленные внеклеточные домены 75 кДа- и 55 кДа-рецепторов, растворимые ФНО-связывающие белки тип А и тип В, соответственно, присутствуют в сыворотках крови больных В-клеточными лейкозами (волосатоклеточным и хрони¬ческим лимфоцитарным). Лечение ИФНом-альфа больных волосатоклеточ¬ным лейкозом приводит к снижению уровней этих белков [Digel et al., 1992]. Отмечено, что при внутривенных инъекциях рекомбинантно¬го ФНО онкологическим больным уровень протеолитического фрагмента 55 кДа-рецептора повышался у всех больных и сохра¬нялся у одного больного до двух суток. Это обстоятельство может существенно снижать биологические эффекты вводимого ФНО [Malik et al., 1991]. В настоящее время в литературе рассматривают только два типа ФНО-рецепторов с молекулярными массами 55 (TNFR-I, CD120a) и 75 кДа (TNFR-II, CD120b), обнаруженных на различных клетках. Считается, что цитотоксичность (апоптоз) ФНО для опухолевых клеток опосредована через активацию 55 кДа-рецептора, только TNFR-I (55 кДа) имеет домен смерти на своей цитоплазматической части [Bazzoni, Beutler, 1996]. В целом на начало 2000-х годов известны восемь членов семейства рецепторов смерти: ФНО-рецептор 1 (TNFRI; также известный как DR1, CD120a, p55 или p60), CD95 (известный как DR2, APO-1 или Fas), DR3 (известный как APO-3, LARD, TRAMP или WSL1), TRAILR1 (связанный с ФНО вызывающий апоптоз рецептор лиганда 1; также известный как DR4 или APO-2), TRAILR2 (также известный как DR5, KILLER или TRICK2), DR6, эктодисплазиновый (ectodysplasin) рецептор (EDAR) и рецептор фактора роста нервов (NGFR). Их отличает цитоплазматический домен размером приблизительно 80 аминокислотных остатков, названный доменом смерти. Когда эти рецепторы активируются соответствующими лигандами, множество молекул привлекается к доменам смерти, и происходит каскад передачи сигналов. Лиганды смерти также взаимодействуют с рецепторами приманками (DcRs), которые не обладают доменами смерти и не могут формировать комплексы передачи сигналов смерти. До настоящего времени четыре рецептора приманки были охарактеризованы: TRAILR3 (также известный как DcR1), TRAILR4 (известный как DcR2), DcR3 и остеопротегрин (OPG) [Lavrik et al., 2005]. Передача сигналов с ФНО-рецептора 1 отличается от CD95-рецептора или TRAILR1/R2-индуцированного апоптоза. Стимуляция TNFRI приводит к формированию двух комплексов передачи сигналов. Комплекс I формируется на мембране и включает TNFRI, ФНО, RIP (взаимодействующий с рецептором белок), TRADD (TNFR-связанный белок домена смерти), TRAF-1/2 (TNFR ассоциированный фактор), и вероятно другие пока ещё не идентифицированные молекулы. Вызывается активация NF-κB-сигнального пути через пополнение IKK-комплекса и активируется JNK через TRAF-2-зависимый механизм (рис. 5).

Рис. 5. Семейство рецепторов смерти и цитоплазматические белки, участвующие в передаче сигнала [Lavrik et al., 2005]. Комплекс I лишен FADD и прокаспазы-8, но перемещается в цитоплазме, где рекрутируются FADD, прокаспазы-8/10 и FLIP-L/S и формируется так называемые траддосомы или комплекс II. Активация прокаспазы-8 происходит в траддосоме и сопровождается активацией передачи сигналов смерти. В этой модели выбор между выживанием и смертью клетки зависит от эффективности формирования комплекса II, активации каспазы-8 и количества FLIP в клетках, который блокирует активацию прокаспазы-8 в комплексе II. Хотя эта модель обеспечивает изящный механизм принятия решения между жизнью и смертью клетки, требуется дальнейшее экспериментальное подтверждение этому [Lavrik et al., 2005]. Однако при действии на клетки через TNFR-1 ФНО может активировать и выживание, и пролиферацию, и апоптоз. Отдельные проводящие пути хорошо определены, в то время как другие остаются неясными (рис. 6).

Рис. 6. Рецептор фактора некроза опухолей 1 (TNFR-1) и его сигнальные пути [van Horssen et al., 2006]. Сокращения: APAF-1 - белок апоптоз-активирующий фактор 1; Bcl-2 – белок В-клеточной лимфомы 2; Bid, Bak, Bax и Bcl-XL - митохондриальные белки Bcl-2-семейства; CAD - активированная каспазой ДНК-аза; Caspase-3/8/9 – цистеиновая аспартаза (апоптотическая протеаза) 3/8/9; Cdc37 - ко-шаперон HSP90; cIAP - цитоплазматический ингибитор апоптоза; cFos/cJun - факторы транскрипции; DD - домен смерти; EndoG - митохондриальная ДНК-аза; FADD - Fas-ассоциированный DD; HSP90 - белок теплового шока 90; I-CAD - ингибитор CAD; IκB - ингибитор NF-κB; IKK α/β - IκB киназа; JNK - cJun N-концевая киназа; MEKK1 - активизированная митогеном протеинкиназа / внеклеточная связанная с сигналом киназа 1; MKK3/7 – MAPK-киназа 3/7; NEMO - NF-κB существенный модулятор; NF-κB - ядерный фактор транскрипции каппа B; NIK - NF-κB индуцирующая киназа; p38MAPK - p38 активированная митогеном протеинкиназа; RIP - взаимодействующий с рецептором белок; SODD - ослабитель доменов смерти; sTNFR-1 - растворимый TNFR-1; ФНО - фактор некроза опухолей альфа; TNFR-1 – ФНО-рецептор 1; TRADD – белок, ассоциированный с DD ФНО-рецептора; TRAF-2 - ассоциированный с ФНО-рецептором фактор 2 [Van Horssen et al., 2006].

Однако ФНО и ИЛ-1 могут проявлять и антиапоптотическое действие через активацию транскрипции как антиапоптотических, так и провоспалительных генов в эндотелиальных клетках человека, как предполагалось через NF-kappaB. При этом оба и ФНО и ИЛ-1 активируют антиапоптотическую протеинкиназу Akt. Фосфорилирование Akt блокируется ингибиторами фосфатидилинозитол-3-киназы (PI-3-киназа). Одни авторы показали, что ФНО и ИЛ-1 активируют PI-3-киназный/Akt антиапоптотический сигнальный путь не через NFkappaB, и что антиапоптотические эффекты Akt являются независимыми от NF-kappaB [Madge, Pober 2000]. Другие доказывают, что фактор транскрипции NF-kappaB и серин-треониновая киназа Akt оба включены в поддержку клеточного выживания и их проводящие пути могут сходиться. Так, IkappaB-киназа, включаемая в активацию NF-kappaB, является субстратом Akt, и поэтому активация Akt стимулирует активность NF-kappaB. Хотя эти результаты помещают Akt вверх по течению активации NF-kappaB, сообщается, что это не обязательно и что Akt может быть целью NF-kappaB. Обработка NIH3T3-клеток активаторами NF-kappaB (ФНО и ЛПС) приводит к стимуляции Akt-фосфорилирования. Стимуляция Akt обнаруживается только после IkappaB-деградации, вызванной этими агентами. Воздействие ингибиторов NF-kappaB блокирует ФНО-индуцированную Akt-активацию. С другой стороны, ФНО-опосредованная активация NF-kappaB не уменьшается ингибиторами киназы, хотя эти ингибиторы полностью блокируют активацию Akt. Эти результаты предполагают, что NF-kappaB требуется для ФНО-опосредованной Akt-активации и что NF-kappaB находится вверх по течению стимуляции Akt [Meng et al., 2002]. В клетках и на уровне целого организма человека ФНО вызывает следующие процессы: - активация фактора транскрипции NF-kappaB, - положительная регуляция каскада киназы I-kappaB /NF-kappaB, - негативная регуляция транскрипции с промотора РНК-полимеразы II, - положительная регуляция транскрипции с промотора РНК-полимеразы II, - регуляция ДНК-зависимой транскрипции, - положительная регуляция каскада JNK, - положительная регуляция транскрипции, - положительная регуляция инициации трансляции ионами железа, - белковый импорт, транслокация в ядро клетки, - регуляция фосфорилирования аминокислот белков, - трансдукция сигналов, - апоптоз, индукция апоптоза через домен смерти рецептора, - антиапоптоз, - негативная регуляция импорта глюкозы, метаболизм глюкозы, - клеточная транссудация, - антибактериальный защитный ответ, - антивирусный ответ, - гуморальный иммунный ответ, регуляция секреции иммуноглобулинов, - адгезия лейкоцитов, - регуляция клеточной пролиферации, - регуляция дифференцирования остеокластов, - органный морфогенез, - развитие многоклеточного организма. Механизм противоопухолевого действия ФНО. До настоящего времени полной и однозначной картины механизма про-тивоопухолевого действия ФНО in vivo не существует. Очевид¬ным является рассмотрение нескольких путей, которыми ФНО уничтожает опухоль или останавливает её рост: • первый из них - непосредственное воздействие белка ФНО на опухолевую клет¬ку-мишень через соответствующие рецепторы на её поверхности со всеми сложными процессами, запускаемыми внутри клетки, конечным результатом которых является апоптоз клетки (цитотоксическое действие) или арест клеточного цикла (цитостатическое действие). В случае последнего события клетка также становится более дифференцированной и экспрессирует ряд антигенов; • второй - каскад химических реакций, включающий активацию коагуляционной системы крови и местных воспалительных реакций, обусловленных ФНО-активиро¬ванными клетками эндотелия и лимфоцитами, и ведущий к так называемому "геморрагическому" некрозу опухолей; • третий путь – блокирование ангиогенеза, приводящее к уменьшению прорастания новыми сосудами быстрорастущей опухоли и, как следствие, к снижению кровоснабжения вплоть до некроза центра опухоли; • и, наконец, четвертый путь, обуславливающий уничтожение опухоли, - воздейс¬твие клеток иммунной системы, цитотоксичность которых оказа¬лась тесно связана с наличием молекул ФНО на их поверхности или процесс созревания/активации этих клеток связан с отве¬том на ФНО. Наличие рецепторов для ФНО на клетке-мишени необходимо, но недостаточно для цитотоксичности. Так нормальные фиброб¬ласты и многие опухолевые клетки имеют рецепторы для ФНО, но резистентны к его цитотоксической активности. Линия Т-лим¬фобластных клеток CCRF-CEM устойчива к ФНО, но ее ва-рианты CEM-VBL10 и CEM-VBL100, экспрессирующие P-гликопроте¬ин и имеющие множественную устойчивость к химиопрепаратам (МЛУ), оказались чувствительными к ФНО. Определение связы¬вания ФНО с исходной линией и ее МЛУ-вариантами показало от¬сутствие различий по числу и аффинности ФНО-связывающих сай¬тов на клетках [Cianfriglia et al., 1991]. Ряд авторов полагает, что ФНО проявляет ци¬тотоксическое действие главным образом или только через вза¬имодействие с 55 кДа рецептором. Через его активацию проис¬ходит также индукция синтеза цитокинов, простагландинов и пролиферация клеток. 75 кДа рецептор играет вспомогательную роль и "представляет" ФНО, находящийся в низких дозах, для 55 кДа рецептора. Пострецепторные меха¬низмы включают через активацию транскрипционного фактора яд¬ра NF-kB транскрипцию генов, программирующих самодеструкцию, и активацию группы Ser/Thr-протеин-киназ, тирозин фосфатазу и фосфолипазу А2, через активацию G-белков, чувс-твительных к коклюшному токсину. Эти процессы приводят к об¬разованию арахидоновой кислоты, инозитол фосфатов, диацилг¬лицерина, фосфатидиловой кислоты и их производных. Эти мета¬болиты прямо или опосредованно активируют новые биохимичес¬кие пути, включая и продукцию митохондриальных радикалов, которые, в конечном счете, и определяют гибель клетки. Однако эта картина имела много белых пятен и была далека от завершения [Beyaert, Fiers, 1994].

Некоторые участники процесса апоптоза показаны на рис. 4. После связывания ФНО с рецептором на поверхности клетки-мишени индуцируется внутриклеточный каскад цитотоксических реакций. Происходит опосредованная G-белком активация фосфо¬липаз, образование свободных радикалов и разрушение ДНК ядра клетки нуклеазами, в конечном счёте, клетки претерпевают апоптоз и погибают [Larrick, Wright, 1990]. ФНО – не только мощный индуктор апоптоза, он также воздействует на переход клеток через фазы клеточного цикла. Вообще, судьба клетки зависит от множества в большинстве своем пока неизвестных факторов. Еще до 90-х годов 20-го века о программируемой клеточной смерти (апоптозе) мало кто знал, общеизвестным был некроз, а теперь в науке речь уже идет о выборе из пяти типов клеточных смертей (табл. 1) [Okada, Mak, 2004] (рис. 5).

Рис. 4. Индукция апоптоза лигандами клеточной смерти (к которым относится ФНО) или химиопрепаратами (drugs) [Petak., Houghton, 2001].

Рис. 5. Факторы, влияющие на судьбу опухоли. На чувствительных к ФНО клеточных линиях Me-180 и MCF-7 и резистентной линии TCC-Sup показана хорошая линейная корреляция, указывающая, что высокими уровнями c-Myc обладают клетки, чувствительные к апоптозу [Baisch, 2001]. При исследовании влияния ФНО на экспрессию и активность антиоксидантных ферментов показана индукция Mn-супероксид¬дисмутазы у линий устойчивых опухолевых клеток и продукция супероксида, возможно, путем активации NADPH-зависимой окси¬дазы у чувствительной линии клеток [Wong et al., 1989]. В возникновении апоптоза опухолевых клеток под воздейс¬твием ФНО не последнюю роль играет экспрессия в этих клетках онкогенов, продукты которых являются ростовыми регуляторами. Так повышенный синтез белков генов p53 и c-mic ведет к раз¬витию апоптоза после воздействия на клетку ФНО. А экспрессия генов bcl-2 и A-20 блокирует апоптоз [Fernan¬dez at al., 1994]. ФНО вызывает продукцию ИЛ-1 клетками эндотелия сосудов и вместе с ним влияет на экспрессию тромбомодулина на по¬верхности эндотелия и прокоагулянтную активность. Эти про¬цессы могут приводить к диссеминированной внутрисосудистой коагуляции, наблюдаемой при сепсисе и различных неопласти¬ческих заболеваниях [Stern et al., 1985, Nawroth, Stern, 1986]. При взаимодействии ФНО с клетками HUVE эндотелия чело¬века происходит включение экспрессии генов первичного отве¬та, среди которых идентифицированы гены поверхностных рецеп-торов: эндотелиальной-лейкоцитарной адгезивной молекулы-1 (ELAM-1) и внутриклеточной адгезивной молекулы-1 (ICAM-1), которые определяют адгезию лейкоцитов и их трансэндотелиаль¬ную миграцию. Кроме этого происходит активация экспрессии генов ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 и моноцит хемотаксического фактора, которые определяют местные воспалительные реакции и нарушают нормальную антикоагулянтную поверхность эндотелия [Wolf et al., 1992]. На последующих рисунках представлен гипотетический механизм ФНО уничтожения солидных опухолей путем "геморрагического некроза" [Van Horssen et al., 2006] (рис. 9-11).

Рис. 6. Последовательные этапы в развитии опухолевого ангиогенеза. Возникающая опухоль в стадии 1 начинает секретировать ангиогенные ростовые факторы (GF) после срабатывания “ангиогенного выключателя”, который достигается разбалансом между про- и антиангиогенными факторами. Ростовые факторы активируют эндотелиальные клетки, окружающие сосуды, и клетки начинают мигрировать (стадия 2) и пролиферировать в сторону опухоли. Эндотелиальная концевая клетка (TC) руководит этим процессом роста сосудов (стадия 3). В стадии 4 новый росток сформировал полость сосуда, и опухоль оказалась связанной с сосудистой сетью, что гарантирует её рост и возможность метастазировать гематогенно. Сокращение: ECM - внеклеточная матрица [van Horssen et al., 2006].

Рис. 7. Различия между здоровым и опухолевым эндотелием и предложенный механизм противоопухолевого эффекта ФНО. (A): Схематическое представление сосуда со здоровым эндотелиальным слоем (верхний) и опухолевым эндотелиальным покровом (нижний). Здоровый эндотелий - непрерывный слой эндотелиальных клеток, закрытых перицитами и тонкой базальной мембраной. Проницаемость низка, и транссудация под сильным контролем. Напротив, опухолевый эндотелий не состоит из непрерывного покрова эндотелиальных клеток; он лишен покрытия перицитами, и базальная мембрана утолщается. Этот фенотип приводит к большей проницаемости опухолевого сосуда (малые стрелки). Выдвигается гипотеза, что опухолевый эндотелий имеет более высокий уровень экспрессии TNFR-1 из-за действия стимулирующих и ростовых факторов, синтезируемых клетками, окружающими сосуд. (B): При лечении ФНО методом изолированной региональной перфузии здоровый эндотелий остается интактным, потому что является ФНО-нечувствительным вследствие низкой экспрессии TNFR-1 на мембране. Опухолевый эндотелий эффективно связывает ФНО, который воздействует на эндотелиальный фенотип и индуцирует апоптоз в этих эндотелиальных клетках. Эти два процесса приводят к индукции высокой проницаемости сосуда (большие стрелки). В результате химиопрепарат хорошо проникает в опухоль, а сильная транссудация эритроцитов приводит к массивному геморрагическому некрозу опухоли. Таким образом, происходит целенаправленная регрессия опухолевых сосудов, которые становятся не функциональными [van Horssen et al., 2006].

Магнитно-резонансное изображение пациента с леиомиосаркомой в верхней части бедра показывает опухоль до лечения (слева). Спустя пять недель после ИРП ФНО и мелфаланом нет накопления гадолиния в остатках опухоли (справа). Когда остатки опухоли были резецированы, опухоль была полностью некротизирована. (B): Ангиографии двух пациентов с быстро растущими саркомами в ноге до (слева) и после (справа) ИРП ФНО и мелфаланом. Ангиографии ясно показывают хорошо развитую опухолевую сосудистую сеть до ИРП, которая была выборочно разрушена после лечения, в то время как нормальные сосуды присутствуют и интактны. Оба пациента были классифицированы, как имеющие полные клинические ответы [Van Horssen et al., 2006]. Естественные киллерные клетки (ЕКК) используют связанный с мембраной ФНО для осуществления лизиса клеток-мишеней, но в отличие от макрофагов не сохраняют цитолитическую активность после фиксации параформальдегидом.

Лизис не возрастает, если перед фиксацией проводят инкубацию с липополисахаридом или рекомбинантным ФНО. Видимо существует несколько путей ис¬пользования ФНО в киллинге опухолей различными эффекторными клетками [Vanderslice, Collins, 1991]. Показано, что ФНО, ИЛ-2 или ИЛ-4 превращают нецитолити¬ческие ЕКК в клетки, осуществляющие медленный лизис, но не влияют на быстрый. Активированные ЕКК синтезируют в больших количествах ФНО, ИФН-гамма, ГМ-КСФ, Г-КСФ и ИЛ-3 [Karre et al., 1991; Ting, Hargrove, 1991].

Рис. 9. Участники врожденного и адаптивного иммунитета. Резистентные к лизису ФНО опухолевые клетки (К562) ли¬зируются моноцитами, экспрессирующими мембрано-ассоциирован¬ный ФНО. Фиксированные формальдегидом моноциты или их мемб¬раны цитотоксичны для клеток-мишеней. Обработка моноцитов ИФН-гамма приводит к усилению цитотоксичности живых и фиксирован¬ных клеток или их экстрагированных мембран. ИФН-гамма модулирует уровень ФНО и его рецептора на мембранах моноцитов. Антитела к ФНО или к его рецептору (htr-9, анти-R55) ингибируют эту цитотоксичность. Инкубация эффекторных клеток с экзогенным ФНО до фиксации формальдегидом повышает их цитотоксичность.

Инкубация клеток-мишеней с ФНО не влияет на уровень цитоли¬за, осуществляемого эффекторными клетками.

Сделан вывод, что ФНО-рецептор на эффекторных клетках, но не на клетках-мише¬нях играет важную роль в ФНО-опосредуемой цитотоксичности моноцитов [Peck et al., 1991]. Участие клеток иммунной системы и цитокинов в распознавании и уничтожении раковых клеток схематично показано на рисунках 9 и 10. Подробнее об этом можно прочесть: Glenn Dranoff. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. Nature Reviews, Cancer, 2004; 4: 11-22.

Рис. 10. Клетки иммунной системы и цитокины, участвующие в распознавании и уничтожении раковых клеток. Следует отметить, что не все опухолевые клетки чувстви¬тельны к цитотоксическому или цитостатическому действию ФНО. Было обнаружено, что устойчивые клетки сами продуцируют эн-догенный ФНО. При этом ингибирование синтеза РНК или белка делает резистентные клетки чувствительными к ФНО. Кроме то¬го, предварительная обработка in vitro клеток низкими дозами ФНО сни¬жает их чувствительность к ФНО и на этом эффекте основан ме¬тод получения ФНО-резистентных линий клеток. При этом было показано, что низкие дозы экзогенного ФНО вызывают синтез эндогенного ФНО. Для доказательства того, что эндогенный ФНО является одним из факторов ФНО-резистентности клеток, был использован метод трансфекции генов в опухолевые клетки. В ФНО-чувствительные L-M клетки липофекцией была введена плаз¬мида pcDV-TNF, кодирующая синтез ФНО человека. Через 36 ча¬сов в культуральной среде трансфецированных клеток определя¬лось 7,8 ЕД/мл активности ФНО. Стабильный трансфектант при последующих исследованиях был полностью резистентен к ФНО. Низкочувствительные к ФНО клетки HeLa, продуцирующие эндо¬генный ФНО были трансфецированы плазмидой pcDAN-8B, кодирую¬щей антисмысловую ФНО м-РНК. Трансфектанты продуцировали значительно меньшие количества эндогенного ФНО и были более чувствительны к цитотоксической активности экзогенного ФНО [Himeno et al., 1990]. В резистентности клеток к ФНО ключе¬выми могут являться другие факторы, например: увеличение внутриклеточного уровня глютатиона [Zimmerman et al., 1989] и Mn-супероксид дисмутазы [Wong et al., 1989]. В частности высокочувствительные к ФНО раковые клетки, трансфецированные ФНО-геном и экспрессирующие эндогенный ФНО, стали резистентны к экзогенному ФНО, при этом у них произошло повышение активности внутриклеточной Mn-супероксид дисмутазы [Okamoto et al., 1992]. Кроме этого на резистентность клеток к ФНО влияют продукты генов ИФН-2 (ИЛ-6) [Defilippi et al., 1987], гена HER2/ERBB2 [Hudziak et al., 1988], а также 14700 Да белок Е3-региона аденовируса [Gooding et al., 1988]. Для изучения ангиогенеза была разработана модельная система, в которой микроваскулярные фрагменты и миофибробласты, изолированные из жировой ткани, выращивают в совместной культуре. Показано, что миофибробласты индуцируют формирование капилляров, продуцируя эндотелиальный клеточный ростовой фактор и секретируя внеклеточную матрицу, которая заставляет эндотелиальные клетки формировать подобную шнуру структуру. В этой системе ФНО-альфа, ЛТ и ИФН-гамма не только значительно замедляли капиллярный рост, индуцированный миофибробластами, но также блокировали капиллярное развитие, индуцированное фибробластными ростовыми факторами (FGF), известными как мощные ангиогенные факторы. Было найдено, что тромбоцит-производный ростовой фактор (PDGF) усиливает формирование капилляров in vitro, вероятно частично, действуя на миофибробласты. Также как и с FGF, капиллярный рост в наличии PDGF был почти полностью блокирован ИФН-гамма. Был исследован способ, которым ИФН-гамма ингибирует ангиогенез и обнаружено, что ИФН-гамма ингибирует и пролиферацию эндотелиальных клеток, и синтез коллагенов миофибробластами. Через эти действия ФНО или ИФН-гамма могут ограничивать формирование сосудов в солидных опухолях [Sato et al., 1990]. Региональное введение больших доз ФНО, ИФН-гамма и мелфалана пациентам с распространенным раком конечностей (см. «Клиническое применение ФНО») приводит к быстрому и специфичному опухолевому некрозу, в то время как нормальные смежные ткани остаются незатронутыми. Опухолевая сосудистая сеть выборочно разрушается этим лечением, и эндотелиальные клетки, кажется, являются ранней и специфичной целью для ФНО и ИФН-гамма. Чтобы проверить это действие, исследовали ответ человеческих макро- и капиллярных эндотелиальных клеток in vitro на экспозицию с большими дозами ФНО и ИФН-гамма (до 40000 ЕД/мл каждого). ФНО и ИФН-гамма синергично замедляли эндотелиально-клеточную пролиферацию до 80 % после 72 часов лечения.

Эффекты на эндотелиально-клеточную пролиферацию и морфологию были обратимы после удаления цитокинов. В отличие от эффекта на клеточную пролиферацию, не было никакого эффекта на эндотелиально-клеточный апоптоз. Представленные данные предполагают, что разрушение in vivo опухолевой сосудистой сети, вызванной большими дозами ФНО и ИФН-гамма, не является следствием их прямого цитотоксического эффекта на эндотелиальные клетки [Yilmaz et al., 1998]. Показано, что роль макрофагов в опухолевом ангиогенезе состоит во влиянии на продукцию ангиогенных цитокинов и ростовых факторов. Недавно было найдено, что макрофаги продуцируют ИФН-гамма, который включен в ангиогенное ингибирование. Таким образом, макрофаги в опухолевом ангиогенезе могут быть ангиогенными выключателями. Резидентные макрофаги из брюшной полости C57BL/6 мышей, инокулированных клетками B16F10 меланомы, не отвечали на ЛПС или ФНО-альфа воздействие, чтобы продуцировать ИФН-гамма. Макрофаги из опухолевого окружения продуцировали ИФН-гамма и VEGF. Однако после добавления ЛПС или ФНО-альфа к макрофагам из опухолевого окружения наблюдалось повышение продукции ими ИФН-гамма и ингибирование опухолевого ангиогенеза. Сделано заключение, что макрофаги в опухолевом окружении могут играть важную роль в ангиогенном и в антиангиогенном сигнале, продуцируя различные цитокины. При этом, ФНО-альфа может быть ключевым цитокином, функционирующим как ангиогенный выключатель в опухолях [Lee et al., 2006].